华南师范大学环境研究院

近日，华南师范大学环境学院应光国教授团队2021级硕士生龙小冰、史文俊副研究员等人在《Journal of Hazardous Materials》上发表了题为“Screening androgen receptor agonists of fish species using machine learning and molecular model in NORMAN water-relevant list”的论文（DOI: 10.1016/j.jhazmat.2024.133844）。该论文通过构建机器学习模型和多种鱼类雄激素受体（AR）分子模型，预测了NORMAN水相关数据集中AR激动剂，并分析了可疑AR激动剂与鱼类AR的结合模式和亲和力。结果表明，结合机器学习和分子模型可快速筛选鱼类AR激动剂，为评估新污染对鱼类生态毒性提供了新的策略。

图文摘要

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雄激素受体（AR）激动剂具有较强的内分泌干扰效应，如引起鱼类性别比例异常和性腺发育受阻。目前研究主要利用人体AR体外研究污染物与其结合能力。然而，快速预测水生生物AR激动剂方法仍然较少。本研究利用机器学习和分子模型筛选鱼类的AR激动剂。在本研究中，首先构建了多种机器学习模型，如深度森林（DF））、随机森林和人工神经网络，用于快速预测AR激动剂，获得高风险物质清单。然后，利用AlphaFold2构建了斑马鱼、黑头呆鱼、食蚊鱼、青鳉鱼和草鱼五种实验室常用鱼类AR分子模型，进一步筛选AR激动剂。最后，通过斑马鱼体内暴露实验，验证虚拟筛选结果。结果表明，深度森林机器学习模型性能优越，准确度和灵敏度分别达到了0.99和0.97。利用机器学习模型，从NORMAN清单中共筛选了245种可疑的AR激动剂，包括糖皮质激素、胆固醇代谢物和心血管药物。分子对接结果进一步显示，大多数可疑的AR激动剂均可与人类AR中的Asn705、Gln711、Arg752和Thr877残基以及5种鱼类AR中相应位点残基结合，对鱼类具有潜在的雄激素效应。

引言

内分泌干扰物（EDCs）是生态毒理学领域研究的热点之一。EDCs可与核受体（NRs）相互作用如雄激素受体（AR），直接或间接干扰激素合成，导致鱼类生殖发育异常。大量研究表明，外源雄激素激动剂对斑马鱼（Danio rerio）, 青鳉鱼（Oryzias latipes）和黑头呆鱼 （Pimephales promelas） 的生殖功能和性特征有强烈影响。睾酮衍生的孕激素左炔诺孕酮和去甲睾酮是雄激素激动剂，可促进睾丸精子成熟，引起斑马鱼雄性化。一些非甾体物质，如全氟烷基酸（PFAAs）和丙氯嗪也会导致斑马鱼雄性增加。化学品在工业、农业和日常生活中的使用越来越多，对鱼类生态风险日趋增加，迫切需要快速筛选可疑的鱼类AR激动剂。

美国环境保护署（U.S. EPA）在2012年开始关注高通量和计算筛选方法来研究AR与化学品之间的结合力。有研究利用定量构效关系（QSAR）和机器学习（ML）方法预测AR结合力，灵敏度（94.7%）和特异性（81.1%）均较高。尽管E-Tox中收集了大量水生生物毒性数据，常用于水生毒性预测，但缺乏公开可用的鱼类NRs高通量分析数据集，这限制了对鱼类AR激动剂的有效预测。本研究旨在通过ML和分子模型的混合方法快速筛选鱼类AR激动剂。我们构建了传统和深度机器学习模型，从NORMAN水相关数据集中筛选了可疑的AR激动剂清单。同时利用AlphaFold2构建斑马鱼、黑头鲦鱼、食蚊鱼、青鳉鱼（Oryzias melastigma）和草鱼的AR分子模型，进一步鉴定了可疑的AR激动剂与鱼类AR结合能力和模式。

图文导读

1. 结合机器学习和分子模型筛选鱼类AR激动剂流程

具体步骤如下：（1）收集和清理训练数据集；（2）生成输入特征；（3）训练机器学习模型；（4）外部验证；（5）使用性能最佳的机器学习模型预测AR激动剂；（6）分析鱼类AR与可疑AR激动剂亲和力和结合方式；（7）实验验证。

Fig. 1. The workflow for screening the suspect AR agonists in the fish species.

图1. 筛选鱼类AR激动剂工作流程

2. 机器学习模型

（1）机器学习模型的性能：使用清洗后训练集的机器学习模型性能远高于使用Tox21原始数据集模型性能（表1）。由表1可以看出，通过训练高质量数据集和Tox21数据集后，模型平衡ACC分别为0.8485 ~ 0.9688和0.6630 ~ 0.7706。同样使用高质量数据集的情况下，相比较于其他传统机器学习和深度学习方法，深度森林表现出最佳的预测性能（表1，图2C）。深度森林模型的灵敏度和f1-score值均高于传统机器学习模型和深度学习模型（表1）。特征输入方面，在相同阈值下，使用分子指纹（MF）和分子描述符（MD）组合特征的深度森林模型AUC和ACC高于使用MF或MD单一特征的深度森林模型。

（2）重要的特征： 通过模型解释发现fr_bicyclic、SMR_VSA4和NumAliphaticCarbocycles是最重要的三个特征（图2D）。fr_bicyclic表示双环结构。SMR_VSA4是一个moe类型描述符，表示MR贡献和表面积贡献。NumAliphaticCarbocycles表示脂肪族（至少含有一个非芳香键）碳环的数目。表明，这些重要特征对于AR激动剂有显著影响（图2D）。

Table 1 Model performances in the test dataset based on the high-quality and Tox21 dataset

表1 基于高质量数据集和Tox21数据集的模型性能

Fig. 2. The performances of machine learning models.

图2. 性能最佳的机器学习模型

3. 鱼类AR的分子模型

（1）人类和鱼类AR亲缘关系：人类、斑马鱼、黑头鲦鱼、食蚊鱼、青鳉鱼和草鱼的AR氨基酸序列具有共同的保守区域（例如，hAR的残基540 - 906）（图3A）。人类氨基酸序列与5种鱼类AR整体相似度为46.85 ~ 50.46%。

（2）AR的三维结构：五种鱼类之间AR LBD的plDDT评分 > 90（图3C）。得分越高，表明5种鱼类的AR LBD结构质量越高。3D结构比较（图3D）显示，不同物种的蛋白质整体折叠高度保守，与AR序列的相似性一致。

（3）关键残基：两种雄激素（睾酮和雄甾酮）和22种孕激素（如地屈孕酮）常与hAR天冬酰胺（Asn） 705、谷氨酰胺（Gln） 711、精氨酸（Arg） 752和苏氨酸（Thr） 877残基中的一个或多个形成氢键。睾酮、雄甾酮、地孕酮（图3E）和左炔诺孕酮也常与zAR的Asn655、Gln661、Arg702和Thr825;fAR的Asn626, Gln632, Arg673和Thr796;moAR的Asn542、Gln548、Arg589、Thr712;meAR的Asn505、Gln511、Arg552、Thr675;gAR的Asn636, Gln642, Arg683和Thr806一个或多个残基形成氢键。有意思的是，鱼类AR与典型雄激素结合的4个关键残基与hAR 4个重要残基均在对应的位点上，并表现出高度的保守性和同源性（图3A, D）。

Fig. 3. Comparison of AR amino acid sequences and 3D structures between human and the five fish species.

图3. 人类与五种鱼类AR结构比对以及关键的氨基酸残基

4. NORMAN列表中可疑AR激动剂

（1）用ML方法预测AR激动剂：使用性能最佳的两种深度森林模型，在NORMAN水相关数据集中，分别筛选出300个和262个可疑AR激动剂。在这两个可疑AR激动剂列表中，共有245个物质被两个模型均预测为AR激动剂（SI图S7）。去除训练数据集中重叠的化学物质，共获得186个可疑的AR激动剂，包括167种类固醇和11种心血管药物（图4C）。

（2）鱼类ARs的亲和力：这些可疑AR与 hAR、zAR、meAR、fAR、moAR和gAR平均结合亲和力分别为-8.730、-8.366、-9.132、-8.619、-8.874和-9.058 kcal/mol。结合分数越低，亲和力越强。在5种鱼类中，T结合亲和力均接近-10 kcal/mol。地塞米松、氯倍他醇丙酸等糖皮质激素的结合亲和力甚至低于T， < -10 kcal/mol。此外，心血管药物和类固醇转化产物在5种鱼类中也表现出高亲和力。例如，coprostanol, 20, 20-ethylenedioxy-17-hydroxy-1, 4, 6-pregnatrien-3-one, stanozolol, 3 beta, 5 beta-dihydroxy drospirenone ring-opened alcohol impurity, epi-coprostanol, fluticason, rimexolone, fluticason furoate, dexamethasone, dexamethasone 21-isonicotinate对5种鱼类ARs具有高亲和力，表明对5种鱼类具有高风险。虽然人类和鱼类的AR具有较高的同源性，但其结合氨基酸也表现出轻微的物种差异（图4D）。

Fig. 4. Model application.

图4. 模型应用

5. 实验验证

本研究选取了粪甾醇（COP）、司坦唑醇（STA）和地塞米松（DEX）进行实验验证。睾酮（T）作为阳性对照。雄激素受体拮抗剂氟他胺（FLU）作为阴性对照。在35dpf时，T、STA、COP和DEX均显著降低了生殖细胞相关基因ddx4、dnd1、fshb、wee2、zar1和zp3b的转录表达水平，导致斑马鱼雄性化（图5A）。相反，FLU增加了这些基因的转录表达水平，导致雌性化（图5A-C）。重要的是，AR激动剂和FLU联合暴露后，显著削弱了AR途径和生殖细胞发育途径中基因转录表达水平和雄性比例（图5A-D）。因此，FLU 与T、STA、COP和DEX联合暴露后均表现有典型的拮抗效应（图5A-D），该结果也再次验证了虚拟筛选的结果。

Fig. 5. Experimental validation in zebrafish.

图5. 斑马鱼实验验证

结论与意义

本研究通过结合机器学习和分子模型，可有效筛选鱼类AR激动剂，获得可疑AR激动剂清单，并评估其对鱼类种群的生态风险。通过本策略，运用机器学习模型从大数据中快速预测AR激动剂，获得规模较小数据集，为后续分子对接分析提供可疑物质清单，从而聚焦高风险AR激动剂。通过构建鱼类AR受体分子模型，进一步分析可疑AR激动剂与鱼类AR中关键氨基酸结合能力，从而预测其对鱼类潜在的雄激素效应，这对于快速评估新污染物对鱼类生态风险具有重要意义。

全文链接

Xiao-Bing Long, Chong-Rui Yao, Si-Ying Li, Jin-Ge Zhang, Zhi-Jie Lu, Dong-Dong Ma, Chang-Er Chen, Guang-Guo Ying, Wen-Jun Shi*. Screening androgen receptor agonists of fish species using machine learning and molecular model in NORMAN water-relevant list. J. Hazard. Mater. 2024, 468, 133844.  

Xiao-Bing Long, Wen-Jun Shi*, Chong-Rui Yao, Si-Ying Li, Jin-Ge Zhang, Zhi-Jie Lu, Dong-Dong Ma, Yu-Xia Jiang, Guang-Guo Ying. Norethindrone suppress the germ cell development via androgen receptor resulting in male bias. Aquat. Toxicol. 2023, 261, 106604.